Isolamento e cultivo de neurônios e neuroesferas de córtex cerebral aviar / Isolation and culture of neurons and neurospheres from chicken brain cortex

Métodos de cultivo celular são convenientes na realização de análises funcionais de alterações/interações protéicas das células neuronais, auxiliando a decifrar o interactoma de proteínas chaves na neurogênese de doenças do Sistema Nervoso Central. Por esse motivo, culturas de neurônios e neuroesferas isolados do córtex cerebral aviar representam um modelo acessível para o estudo de diversas doenças neurológicas, tal como a epilepsia. A espécie aviar apresenta peculiaridades em seu proteoma neuronal, visto a presença de uma expressão diferenciada de proteínas chaves no metabolismo energético cerebral, algumas destas (VDAC1 e VDAC2) desempenham papel importante na compreensão do mecanismo da epilepsia refratária. A metodologia estabelecida no presente estudo obteve cultivo de neuroeferas, onde as células cresceram tipicamente em aglomerados atingindo, dentro de 7 dias, o diâmetro ideal de 100-200 µm. A diferenciação celular das neuroesferas foi obtida após a aderência destas às placas tratadas com poli-D-lisina, evidenciada pela migração de fibras do interior da neuroesfera. Ao contrário das neuroesferas, os neurônios em cultivo extenderam seus neuritos após 11 dias de isolamento. Tal modelo in vitro pode ser utilizado com sucesso na identificação das variáveis neuroproteômicas, propiciando uma avaliação global das alterações dinâmicas e suas interações protéicas. Tal modelo pode ter aplicações em estudos dos efeitos de indutores da morte celular e bloqueadores de canais de membrana mitocondriais em proteínas chaves do metabolismo energético cerebral.

Cell culture methods are used for studies of protein interactions in neural cells, helping to detect the interactome of proteins linked to generation of central nervous system diseases. For this reason, neural cells and neurospheres isolated from cortical chicken brain are a current model for studies of neurological diseases, such as epilepsy. Chicken brain has key characteristics on its proteome, with a differential expression of proteins linked to energy metabolism, some of them (VDAC 1 and VDAC 2) play an important role in understanding mechanism of refractory epilepsy. Using the methods described, we found neurospheres, in which cells grow in structures with the ideal diameter of 100-200µm within seven days after isolation. Neurospheres differentiation was obtained after adhesion of these cells to surfaces coated with poly-D-Lysine, detected by migration of fibers inside them. Unlike neurospheres, neurons extended neurites after 11 days of isolation. Here we describe a method to isolate and culture neurons and neurospheres from chicken cerebral cortex. Such "in vitro" model can be utilized on studies of neuronal protein differential expression and interaction. Cultures of isolated neurons represent an accessible model on studies of apoptosis and channel blockers of key proteins linked to brain metabolism.

Purificação e caracterização da VDAC de mitocôndrias corticais aviares: identificação de modificações pós-traducionais nas porinas neuronais murinas e aviares / Purification and characterization of avian cortical mitochondrial VDAC: identification of post-translational modifications of rat and avian neuronal porins

A VDAC é uma porina presente na MME cuja função é crucial no metabolismo energético, sobrevivência e morte celular. A caracterização da VDAC torna-se importante para a compreensão das inter-relações da mitocôndria com os diferentes componentes citosólicos, tais como a HK. A ligação HK-VDAC favorece a utilização do ATP intramitocondrial em células neuronais, a HK cerebral pode interagir de formas diferentes com a VDAC, o que resulta em diferentes sítios de ligação (sítios A e B). Os variados papéis metabólicos das isoformas da VDAC podem ser explicados pela presença de alterações pós-traducionais. No presente trabalho purificamos a VDAC1 mitocondrial neuronal proveniente de cérebro aviar. Paralelamente, comprovamos que a presença de múltiplas formas das VDACs 1 e 2 em cérebros murino e aviar, seja devida à presença de modificações pós-traducionais, nomeadamente a fosforilação. A proteína isolada apresentou peso molecular de 30KDa. Quando submetida à eletroforese e posteriormente à coloração para a identificação de fosfoproteínas, a mesma mostrou-se desfosforilada. O conhecimento da presença, ou ausência de fosforilação das VDACs, reside na importância de estabelecer-se as bases moleculares ligadas à existência de sítios A e B nas mitocôndrias neuronais.

VDAC (voltage-dependent anion channel) is a pore forming protein from outer mitochondrial membrane. It has key functions on energetic metabolism, and cell death and survival. VDAC characterization is important for understanding mitochondrial interactions with cytosolic proteins, such as hexokinase (HK). HK-VDAC interaction supports preferential access to intramitochondrial ATP in neural cells. Brain HK interacts in different ways with VDAC. It results in two HK binding sites (A and B). VDAC isoforms differential metabolic roles may be explained by the presence of post-translational modifications. In this study we purified avian neuronal mitochondrial VDAC1. At same time we showed that VDACs 1 and 2 pI heterogeneity in rat and avian brains is due to phosphorylation. Purified VDAC had a molecular weight of 30 KDa. The purified VDAC submitted to phosphorylated protein staining on gel, was dephosphorylated. The knowledge of presence or absence of VDAC phosphorylation is important for understanding the molecular nature basis of A and B HK binding sites in brain mitochondria.

Análise interactômica da VDAC (voltage-dependent anion selective channel) nos cérebros aviar, bovino e murino / Interactomic analysis of VDAC (voltage-dependent anion selective channel) in rat, bovine and chicken brain

A VDAC é a proteína mais abundante na membrana mitocondrial externa. Exerce o controle da atividade desta organela através da regulação da troca de metabólitos e tem função crucial no mecanismo de apoptose. Em nosso caso, os estudos dos complexos protéicos, das interações entre a VDAC e outras proteínas presentes no interior do neurônio que auxiliam na manutenção das funções das organelas e da célula, fazem parte da chamada interactômica. O presente estudo determinou o interactoma do complexo protéico He-xoquinase-VDAC-ANT presente em cérebros murino, bovino e aviar. Nosso objetivo foi identificar se as expressões diferenciadas da VDAC1 e VDAC2 verificadas nos cérebros murino, aviar e bovino, estão associadas a diferenças nos interactomas dessas proteínas. Este estudo revelou que as espécies aviar e bovina apresentaram o maior número de complexos protéicos contendo VDACs (5) quando comparadas com os neurônios de rato (1), o que é indicativo de uma cinética diferencial de montagem ou desmontagem do complexo. Além disso, a VDAC mitocondrial neuronal aviar também interage com mais proteínas em relação à VDAC mitocondrial neuronal bovina, o que é resultado de uma composição de subunidades diferenciada. Tais resultados indicam diferenças significativas quanto ao metabolismo energético e apoptótico no cérebro aviar, bovino e murino, existindo interações diferenciais da VDAC no cérebro aviar.

The voltage dependent anion channel (VDAC) is the most abundant protein of outer mitochondrial membrane. VDAC controls metabolite exchange through this membrane and the apoptosis machinery. Interactomics is the study of protein complexes, their interactions and the consequences of these interactions. In our case we studied the interactome of the hexokinase-VDAC-ANT (adenine nucleotide transporter) complex in mitochondria of neuronal cells from rat, bovine and chicken brain. We wished to understand if the differential expression of VDAC1 and VDAC2 verified in these cells was linked to differences in the interactions between proteins in these complexes. Our results showed that avian and bovine neurons had more protein complexes (5) containing VDAC than rat cells (1), which indicates a differential kinetics of assembly or disassembly. Moreover, mitochondrial neuronal chicken VDAC interacts with more proteins in comparison with bovine neuronal VDAC, which is indicative of a differential subunit composition. These results supported evidences of differential apoptotic and energetic mechanisms between these brains.

Estradiol-17β altera expressão proteica endometrial em fêmeas bovinas tratadas no 17º dia do ciclo estral / 17β-estradiol alters endometrial protein expression in bovine females treated at the 17th day of estrous cycle

Em fêmeas bovinas, a liberação de prostaglandina F2α (PGF2α) é induzida in vivo pelo estradiol (E2). Acredita-se que o E2 estimule a síntese de proteínas essenciais na produção de PGF2α. Objetivou-se avaliar o efeito do E2 no incremento da concentração de proteínas totais e na modificação da composição proteica em explantes endometriais de fêmeas bovinas tratadas com E2 no 17º dia do ciclo estral. Novilhas cruzadas foram tratadas no 17º dia do ciclo estral, via intravenosa, com 0 mg (Grupo Controle; n = 6) ou 3 mg de E2 (Grupo E2; n = 6) e abatidas duas horas após. Explantes endometriais foram isolados, submetidos à extração de proteínas totais, quantificados e avaliados por Eletroforese Unidimensional em gel de poliacrilamida 10% SDS-PAGE. A concentração de proteínas totais não diferiu entre os grupos, 6296,10 + 439,90 µg/mL para o Grupo Controle e 8426,56 + 1156,00 µg/mL para o Grupo E2 (p = 0,1158). Não houve diferença significativa (p > 0,05) no perfil proteico dos explantes endometriais em géis corados com Coomasie Blue. Em géis corados com Nitrato de Prata verificou-se no Grupo E2 maior porcentagem relativa das bandas referentes ao peso molecular de 75 a 76 kDa (8,40% vs. 4,89%; no Grupo E2 e Controle respectivamente; p < 0,05) e 108 a 110 kDa (6,85% vs. 3,84%; no Grupo E2 e Controle respectivamente; p < 0,05). Observou-se no Grupo E2 menor porcentagem relativa da banda referente ao peso molecular de 90 kDa (5,78% vs. 9,83%; no Grupo E2 e Controle respectivamente; p < 0,05). Conclui-se que o E2 não incrementa a concentração de proteínas no endométrio, entretanto, altera a composição proteica nos explantes endometriais, indicando que o E2 altera a expressão de proteínas específicas.

In bovine females the release of prostaglandin F2α (PGF2α) is induced in vivo by estradiol (E2). It is believed that E2 stimulates the synthesis of essential proteins for the production of PGF2α. This study aimed to evaluate the effect of E2 in increasing the concentration of total protein and modifying the protein composition of endometrial explants from bovine females treated with E2 at the 17th day of estrous cycle. Crossbred heifers were treated at 17th day of estrous cycle intravenously with 0 mg (Control Group; n = 6) or 3 mg of E2 (E2 Group; n = 6) and killed two hours after. Endometrial explants were isolated, subjected to extraction of total protein, quantified and were analyzed by one-dimensional electrophoresis on polyacrylamide gel 10% SDS-PAGE. The concentration of total protein did not differ between groups, 6296.10 + 439.90 µg/mL for the Control Group and 8426.56 + 1156.00 µg/mL for E2 Group (p = 0.1158). There was no significant difference (p > 0.05) in the protein profile of endometrial explants in gels stained with Coomasie Blue. In gels stained with Silver Nitrate it was verified in E2 Group greater relative percentage of the bands referring to the molecular weight of 75 to 76 kDa (8.40% vs. 4.89% in E2 Group and Control respectively; p < 0.05) and 108 to 110 Kda (6.85% vs. 3.84% in E2 Group and Control respectively, p < 0.05). It was observed in E2 Group lower relative percentage of the band referring to the molecular weight of 90 kDa (5.78% vs. 9.83% in E2 Group and control respectively; p < 0.05). We concluded that the E2 does not increase the protein concentration in the endometrium, however, it modifies the proteinic composition in the endometrial explants, indicating that E2 alters the expression of specific proteins.